Prinsip kerja dari ekstraksi DNA / DNA Extraction

Prinsip kerja dari ekstraksi DNA / DNA Extraction

1. Preparasi sel/jaringan 

Darah yang digunakan leukositnya, eritrosit dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi untuk mendapat hasil optimal,leukosit disimpan sebaiknya pada suhu 4 derajat C, penyimpanan yang lama (> 1 bulan) akan menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 – 5 ml whole blood. 
Jaringan yang diambil secepatnya diekstraksi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam paraffin blok sulit untuk diekstraksi.

2. Lisis membran sel/organella (nukleus)

Senyawa yang digunakan untuk melisiskan membran yaitu Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk melisiskan membran, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksik, digunakan sebagai pengganti phenol

3. Denaturasi senyawa organik 

Untuk medenaturisasi protein yang ada digunakan senyawa Kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan Proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi .

4. Presipitasi DNA

Digunakan senyawa Isopropanol dengan volume 1:1, atau Ethanol absolut dan sodium asetat 1:10

5. Pencucian/washing

Pencucian sisa senyawa mengunakan Ethanol 70%

Metode-metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA

1. Phenol:chloroform 

Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol

2. Salting Out

Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein

3. Guanidine isothiocyanate 

Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

4. Silica Gel

Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang. 

Pengukuran kualitas DNA 

Kualitas DNA yaitu utuh, tidak putus-putus, konsentrasinya tinggi dan tidak banyak terkontaminasi protein. Menentukan kualitas DNA dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (protein 280 nm; DNA baik apabila pengukuran pada 260:280 = 1,7 – 1,9). Satu OD = 50 ng DNA. Dilihat dengan elektroforesis, band yang tebal secara kualitatif menunjukkan DNA yang bagus 

Penyimpanan DNA 

DNA disimpan dalam TE buffer (tris-hydroxymethyl amino methana – EDTA), Disimpan – 80 derajat bisa tahan bertahun-tahun. Untuk kerja, sebaiknya disiapkan DNA yang sudah diencerkan menjadi 100 ng/mikroliter. Freezing – thawing berulang dapat meyebabkan kerusakan DNA.

Sumber: http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/2111537-ekstraksi-dna-dna-extraction/#ixzz1PpjzceKq